Regeneracja wysp trzustkowych in vivo za pomocą terapii genowej ukierunkowanej na ultradźwięki | Terapia genowa

Regeneracja wysp trzustkowych in vivo za pomocą terapii genowej ukierunkowanej na ultradźwięki | Terapia genowa

Anonim

Tematy

  • Cukrzyca
  • Wysepki Langerhansa
  • Ultradźwięk

Abstrakcyjny

W tym badaniu zastosowano nowe podejście do terapii genowej, w której plazmidowy DNA jest ukierunkowany na trzustkę in vivo przy użyciu ukierunkowanego na ultradźwięki zniszczenia mikropęcherzyków (UTMD) w celu osiągnięcia regeneracji wysepek. Dożylne mikropęcherzyki niosące plazmidy są niszczone w mikrokrążeniu trzustki za pomocą ultradźwięków, osiągając lokalną ekspresję genów, która jest dalej ukierunkowana na komórki β za pomocą zmodyfikowanego szczurzego promotora insuliny (RIP3.1). Szereg genów zaangażowanych w rozwój hormonalny dostarczono szczurom 2 dni po cukrzycy wywołanej streptozotocyną. Geny PAX4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 , Ngn3 i Mafa wytwarzały hiperplazję komórek α, ale bez znaczącej poprawy masy komórek beta lub poziomu glukozy we krwi 30 dni po UTMD. W przeciwieństwie do tego, RIP3.1-NeuroD1 promował regenerację wysp po przeżywających komórkach β, z normalizacją poziomu glukozy, insuliny i peptydu C po 30 dniach. W długoterminowym eksperymencie u czterech z sześciu szczurów nastąpił powrót cukrzycy po 90 dniach, któremu towarzyszyła apoptoza komórek β po barwieniu Tunelem. Wstępne leczenie inhibitorem JNK SP600125 z powodzeniem zablokowało apoptozę komórek β i spowodowało przywrócenie masy komórek β i normalizację poziomu glukozy we krwi do 90 dni. Ta technika pozwala na regenerację wysepek in vivo , przywrócenie masy komórek β i normalizację poziomu cukru we krwi, insuliny i peptydu C u szczurów bez wirusów.

Wprowadzenie

Kontrola poziomu glukozy we krwi jest często niewystarczająca w cukrzycy, ponieważ terapia lekowa, w tym zastępowanie insuliny, nie jest w stanie odtworzyć funkcji regulacyjnej glukozy normalnych wysp. W związku z tym nowe strategie leczenia skupiły się na uzupełnieniu niedoboru masy komórek β, który jest wspólny dla obu głównych postaci cukrzycy poprzez przeszczep wysp lub regenerację komórek β. 1, 2 Przeszczep wysp został ograniczony przez podaż wysp dawców i potrzebę terapii immunosupresyjnej. 3 Regeneracja wysepek zakończyła się sukcesem w modelach zwierzęcych, głównie ukierunkowanych na tkankę wątroby za pomocą wektorów wirusowych 4, 5, 6, 7, które ze względów bezpieczeństwa raczej nie będą stosowane u ludzi. Nowatorskie podejście do terapii genowej polega na ukierunkowaniu dostarczania DNA na wysepki trzustkowe przy użyciu ukierunkowanego na ultradźwięki zniszczenia mikropęcherzyków (UTMD). 8, 9 Dożylne mikropęcherzyki niosące plazmidowy DNA są niszczone w mikrokrążeniu trzustki za pomocą ultradźwięków, uzyskując lokalną ekspresję genów, która może być dalej ukierunkowana na komórki β przy użyciu zmodyfikowanego szczurzego promotora insuliny I. UTMD zastosowano do dostarczania betaceluliny i PDX1 u szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ), z odwróceniem cukrzycy na okres do 15 dni poprzez przeprogramowanie trzustkowych komórek groniastych w komórki wytwarzające insulinę. Podobnie wykazano , że bezpośrednie wstrzyknięcie adenowiru kodującego kombinację genów PDX1 , neurogeniny3 i Mafa do mysiej trzustki przeprogramowuje komórki zewnątrzwydzielnicze w małe komórki wytwarzające insulinę bez tworzenia wysepek. Jednak regeneracja wysepek w trzustce pozostaje nieuchwytnym celem terapii genowej. Badanie to miało na celu ocenę, czy regenerację wysepek można osiągnąć w trzustce dorosłego szczura za pomocą terapii genowej z użyciem UTMD.

Rozwój embriologiczny trzustki hormonalnej związany jest z aktywacją wielu genów kodujących różne czynniki transkrypcyjne i inne białka. 12, 13 Uznając, że mogą istnieć istotne różnice między noworodkowym rozwojem endokrynnym a regeneracją wysepek u dorosłego zwierzęcia z cukrzycą, staraliśmy się ocenić, czy można to osiągnąć za pomocą terapii genowej skierowanej przeciwko trzustce przez UTMD. Specjalnie skonstruowaliśmy plazmidy kodujące cDNA dla Ngn3 , Pax4 , Nkx2.2, Nkx6.1, MafA i NeuroD1 , wszystko pod kontrolą zmodyfikowanego szczurzego promotora insuliny (RIP3.1). Mikropęcherzyki zawierające te geny podawano dożylnie w ciągu 10 minut, podczas gdy ultradźwięki zastosowano do zniszczenia mikropęcherzyków w mikrokrążeniu trzustki. UTMD wykonano 48 godzin po indukcji cukrzycy przez dootrzewnowe STZ (60 mg kg -1 ). Kontrole obejmowały UTMD z genem markerowym (RIP3.1-DsRed), STZ tylko bez terapii genowej, a także normalne kontrole, które nie otrzymały STZ. Przeprowadzono trzy różne powtórzenia eksperymentów z eutanazją po 10 dniach, 20 dniach i 30 dniach, aby ocenić morfologię wysepek i ekspresję genów. Wyniki 30-dniowego eksperymentu pokazano na rycinach. Przeprowadzono również długoterminowy eksperyment z użyciem RIP3.1- NeuroD1, po tym , jak wykazano, że gen ten jest optymalny do regeneracji wysepek w tym modelu.

Wyniki

Wpływ endokrynnych genów proliferacyjnych na strukturę wysepek

Rycina 1 pokazuje reprezentatywne próbki histologiczne barwione przeciwciałami anty-insulinowymi znakowanymi FITC (kolor zielony) i przeciwciałami anty-glukagonalnymi znakowanymi CY5 (kolor czerwony). Skrawki te uzyskano z grupy szczurów zabitych 30 dni po UTMD. Normalne wysepki zawierają centralny rdzeń komórek β (zielony) otoczony mniejszą liczbą komórek α (czerwony) na obrzeżach wyspy. Po STZ normalna architektura wysepek zostaje praktycznie zniesiona, a od czasu do czasu pozostają izolowane komórki β lub małe skupiska komórek β. Terapia genowa Ngn3 , Pax4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 i MafA spowodowała regenerację wysepek, ale z nieprawidłową architekturą wysepek, w których dominowały komórki α. Natomiast terapia genowa NeuroD1 spowodowała regenerację wysepek o stosunkowo normalnej morfologii. Co ciekawe, w grupie NeuroD1 (Ryc. 2) było kilka komórek, które kosztowały anty-insulinę i anty-glukagon, ale nie w normalnych wysepkach. To odkrycie zostało wcześniej zgłoszone jako marker proliferacji hormonalnej. 13 Mikroskopia konfokalna wykazała również kolokalizację anty-insuliny i anty-Ki67, wskazując na proliferację komórek β (danych nie pokazano). W porównaniu z prawidłowymi i traktowanymi STZ grupami kontrolnymi, komórki Ki67-dodatnie były statystycznie i znacznie liczniejsze (10 ± 2% komórek insulino-dodatnich, P <0, 0001) w grupie NeuroD1 niż w kontrolach (tylko rzadkie komórki Ki67-dodatnie) . Ponieważ NeuroD1 był pod kontrolą promotora RIP3.1, postawiliśmy hipotezę, że obserwowana regeneracja wysepek była spowodowana replikacją komórek β, które przeżyły STZ. Poparły to trzy obserwacje. Po pierwsze, nie było dowodów na regenerację wysepek, gdy RIP3.1- NeuroD1 został dostarczony przez UTMD 7 dni po STZ, w punkcie czasowym, w którym nie stwierdzono resztkowych komórek β w kontrolach STZ. Po drugie, żadna z wysepek indukowanych przez RIP3.1- NeuroD1 nie wyrażała CK19, co wskazuje, że nowe wysepki nie pochodziły z komórek przewodowych. Po trzecie, kolokalizacja Ki67 i insuliny sugeruje proliferację komórek β.

Image

Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej. Grupa paneli obrazujących po lewej stronie przedstawia reprezentatywne przykłady wysepek z 30-dniowych eksperymentów. Komórki β są barwione anty-insuliną (kolor zielony), podczas gdy komórki are są barwione anty-glukagon (kolor czerwony). Lewy górny panel pokazuje normalną wysepkę z centralnym rdzeniem komórek β otoczonych komórkami α na obrzeżach wysepki. Kontrole traktowane streptozotocyną (STZ), ale bez aktywnej terapii genowej, wykazują utratę integralności wysepek, z kilkoma bardzo komórkami β otoczonymi komórkami α (górna środkowa i prawa strona). Terapia genowa ukierunkowana na ultradźwięki z użyciem Nkx2.2 , Nkx6.1 , Pax4 , Ngn3 i MafA spowodowała powstanie wysp dominujących komórki α. Przeciwnie, szczury traktowane NeuroD1 miały prawie normalną architekturę wysepek, z centralnymi komórkami β otoczonymi obwodowymi komórkami α (zdjęcie po prawej u dołu). Wykresy przedstawiają poziomy glukozy we krwi (prawy górny panel), insuliny we krwi (prawy środkowy panel) i peptydu C (prawy dolny panel) w 30-dniowym eksperymencie. W dniu 3 wszystkie szczury traktowane STZ miały znacząco podwyższony poziom glukozy we krwi i zmniejszały poziom insuliny i peptydu C w porównaniu do normalnych kontroli ( p <0, 0001). Jednak do 30 dnia tylko szczury traktowane NeuroD1 miały przywrócenie poziomu glukozy we krwi, insuliny i peptydu C do normalnego lub prawie normalnego poziomu.

Pełny rozmiar obrazu

Image

Górne panele pokazują reprezentatywną wysepkę szczura traktowanego NeuroD1 . Anty-insulina (zielony) jest pokazana na lewym panelu, wraz z obrazowaniem anty-glukagonu (środkowy) i konfokalnym (prawy). Konfokalny obraz pokazuje kolokalizację insuliny i glukagonu to niektóre komórki (żółte), co wskazuje na proliferację hormonalną. Wykres pokazuje, że kolokalizacja insuliny i glukagonu jest znacznie częstsza u szczurów leczonych NeuroD1 niż u kontroli ( * P <0, 0001).

Pełny rozmiar obrazu

Wpływ endokrynnych genów proliferacyjnych na poziom glukozy we krwi, insuliny i peptydu C.

Rycina 1 pokazuje również wykresy poziomu glukozy we krwi (prawy górny róg), insuliny (środkowy prawy) i peptydu C (dolny prawy) na początku, 3 dni po STZ i 30 dni po STZ. Poziom glukozy we krwi gwałtownie wzrósł do 3 dnia u wszystkich szczurów leczonych STZ (około 400 mg na 100 ml) i pozostawał podwyższony w dniu 30, z wyjątkiem szczurów traktowanych NeuroD1 . W dniu 30 poziom glukozy we krwi wynosił 101 ± 11 mg na 100 ml u szczurów traktowanych NeuroD1 , który był statystycznie i znacznie niższy niż we wszystkich innych grupach traktowanych STZ ( P <0, 0001), ale nie u normalnych kontroli. W eksperymentach krótkoterminowych poziom glukozy we krwi był również normalny w dniach 10 i 20 u szczurów traktowanych NeuroD1 (danych nie pokazano). Poziomy insuliny i peptydu C były wyraźnie obniżone w dniu 3 u wszystkich szczurów traktowanych STZ. Do dnia 30 poziomy insuliny i peptydu C były prawie normalne u szczurów traktowanych NeuroD1 , statystycznie i znacznie wyższe niż w dniu 3 lub wyższe niż we wszystkich innych grupach leczonych STZ ( P <0, 0001).

Wpływ endokrynnych genów proliferacyjnych na liczbę wysp i masę komórek β

Morfometria wysepki 30 dni po UTMD pokazano na rycinie 3. Górne panele są reprezentatywnymi skrawkami o niskiej mocy zabarwionymi hematoksyliną (niebieską) i anty-insuliną (brązową) od normalnych kontroli (po lewej), szczurów traktowanych Ngn3 (środek) i NeuroD1 leczone szczury (z prawej). Liczbę wysepek w różnych grupach leczenia pokazano na lewym dolnym wykresie na rycinie 3. W normalnych kontrolach było 61 ± 6 wysepek na szkiełko, w porównaniu z tylko 3 ± 2 po samym leczeniu STZ. NeuroD1 dawało 37 ± 4 wysepek na szkiełko, liczbę, która była statystycznie i znacznie wyższa niż we wszystkich innych grupach, z wyjątkiem normalnych kontroli ( p <0, 0001). Masę komórek β pokazano na prawym dolnym wykresie na ryc. 3. Masa komórek β wynosiła 1, 49 ± 0, 17% w normalnych kontrolach i była znacznie zmniejszona w kontrolach traktowanych STZ (0, 04 ± 0, 01%) i kontrolach DsRed (0, 05 ± 0, 01 %). W grupach leczonych PAX4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 , Ngn3 i Mafa , masa komórek β była podobna (0, 20 ± 0, 04%). Jednak u szczurów leczonych terapią genową NeuroD1 masę komórek β przywrócono do około połowy masy normalnej kontroli (0, 76 ± 0, 07%). Masa komórek β była statystycznie i znacznie wyższa dla szczurów traktowanych NeuroD1 niż dla wszystkich innych genów i kontroli ( P <0, 0001), ale była mniejsza niż dla normalnych kontroli ( P = 0, 0006).

Image

Wyniki morfometrii wysepek. Górny panel pokazuje reprezentatywne wysepki o niskiej mocy po barwieniu hematoksyliną i anty-insuliną (kolor brązowy). Normalne wysepki kontrolne (po lewej) pokazują gęste, dobrze uformowane rdzenie komórek β zabarwione antyinsuliną (brązowe). Po terapii genowej Ngn3 (środek), obecne są rozproszone komórki β, ale bez dobrze uformowanych rdzeni wysp. Po terapii genowej NeuroD1 rdzenie wysepek mają prawie normalny wygląd. Dolny lewy panel pokazuje liczbę wysp na slajd dla różnych grup. Zarówno normalne kontrole, jak i szczury traktowane NeuroD1 miały znacznie więcej wysepek na szkiełko niż wszystkie inne grupy ( * P <0, 0001 według ANOVA). Dolny prawy panel pokazuje masę komórek β. Szczury traktowane NeuroD1 miały masę komórek β, która była o połowę mniejsza niż normalnych kontroli ( P <0, 0001). Zarówno normalne kontrole, jak i szczury traktowane NeuroD1 miały znacznie wyższą masę komórek β niż wszystkie inne grupy ( * P <0, 0001 według ANOVA).

Pełny rozmiar obrazu

Czas trwania regeneracji wysp po terapii genowej RIP3.1-NeuroD1

Rycina 4 pokazuje wysepki zabarwione anty-insuliną (zielony), anty-NeuroD1 (czerwony) i konfokalne obrazy na wyspach od normalnych kontroli, kontroli traktowanych STZ i grupy NeuroD1 w dwóch punktach czasowych, 2 i 4 tygodnie po UTMD. Brak sygnału NeuroD1 na wyspach normalnych lub leczonych STZ szczurów. U szczurów leczonych terapią genową NeuroD1 , NeuroD1 jest obecny po 2 tygodniach, ale nie 4 tygodni po UTMD. Jest to zgodne z naszym poprzednim raportem, że ekspresja plazmidowego DNA przez UTMD osiąga maksimum 4–7 dni po leczeniu i praktycznie zniknęła po 4 tygodniach. Zatem przejściowa ekspresja genu przez UTMD wyzwala regenerację wysepek, która utrzymuje się po usunięciu dostarczonego genu i białka ulegającego ekspresji. Aby określić czas trwania regeneracji wysp i kontroli poziomu glukozy we krwi po UTMD, grupę sześciu różnych szczurów potraktowano terapią genową NeuroD1 2 dni po STZ i zabito 90 dni później. Wyniki tego eksperymentu pokazano na rycinie 5. Wszystkie sześć szczurów miało głęboką hiperglikemię na początku (2 dni po STZ). W dniach 20 i 30 wszystkie sześć szczurów miało normalny poziom glukozy we krwi (wykres, lewy panel). Jednak do 90 dnia cztery z sześciu szczurów powróciły z ciężką hiperglikemią, podczas gdy dwa szczury pozostały normoglikemiczne. Mikroskopia konfokalna wykazała znaczną utratę komórek β w centrum wysepki szczurów hiperglikemicznych (u góry po prawej), w porównaniu ze szczurami normoglikemicznymi (u dołu po prawej), które zachowały architekturę wysepek.

Image

Barwienie immunologiczne na obecność białka NeuroD1 u normalnych kontroli (panele górne), szczurów traktowanych STZ (panele drugie), 2 tygodnie po terapii genowej NeuroD1 (panele trzecie) i 4 tygodnie po terapii genowej NeuroD1 (panele dolne). Lewe panele wybarwiono anty-insuliną FITC (zielony); panele środkowe z anty-NeuroD1 CY5 (czerwony); a prawe panele są konfokalne. Wykrywalne poziomy NeuroD1 są widoczne w komórkach β 2 tygodnie, ale nie 4 tygodnie po docelowym ultradźwiękowym zniszczeniu mikropęcherzyków (UTMD).

Pełny rozmiar obrazu

Image

Czas trwania terapii genowej NeuroD1 po cukrzycy indukowanej przez STZ. Wykres pokazuje poziomy indywidualnego poziomu glukozy we krwi u sześciu szczurów leczonych UTMD 2 dni po STZ (BSL). Głęboka hiperglikemia zostaje przywrócona do normy u wszystkich sześciu szczurów za pomocą terapii genowej NeuroD1 w dniach 20 i 30. Do 90 dnia dwa szczury pozostają normoglikemiczne, a cztery szczury powróciły do ​​ciężkiej cukrzycy. Konfokalne obrazy mikroskopowe z reprezentatywnych wysepek pokazano na prawych panelach, zabarwionych anty-insuliną (zielony) i anty-glukagon (czerwony). Szczury z cukrzycą mają niewiele obecnych komórek β (u góry po prawej), podczas gdy szczury normoglikemiczne zachowały architekturę wysepek (u dołu po prawej).

Pełny rozmiar obrazu

Wydłużenie żywotności wysp przez hamowanie kinazy N-końcowej c-Jun

Postawiliśmy hipotezę, że ta późna utrata wysp była spowodowana apoptozą. Dlatego eksperyment powtórzono przez wstępne traktowanie SP600125, inhibitorem kinazy N-końcowej c-Jun (JNK), który, jak wykazano, blokuje apoptozę za pośrednictwem JNK w wysepkach. 14 Rycina 6 pokazuje wyniki barwienia Tunelem u normalnych kontroli ( n = 3), u szczurów z cukrzycą leczonych STZ ( n = 3) i u szczurów STZ leczonych terapią genową NeuroD1 z ( n = 6) i bez SP600125 ( n = 6). Apoptoza (zielony sygnał) została zniesiona w grupie NeuroD1 UTMD, która została poddana wstępnej obróbce SP600125. Rycina 7 pokazuje morfometrię wysepek i pomiary glukozy we krwi 90 dni po terapii genowej NeuroD1 z SP600125 i bez. Lewe panele przedstawiają reprezentatywne wysepki u szczurów, które nie otrzymały SP600125 (u góry) w porównaniu z tymi, które wycofały się z SP600125 (u dołu). Duże dobrze uformowane wysepki zaobserwowano w grupie SP600125, w porównaniu z małymi skupiskami komórek β obecnych w kontrolach (nr SP600125). Masa komórek β wynosiła 0, 61 ± 0, 07% w grupie SP600125 w porównaniu z 0, 37 ± 0, 07% w grupie kontrolnej ( P <0, 0001; prawy górny wykres). Poziom glukozy we krwi po 90 dniach pokazano na prawym dolnym wykresie na ryc. 7. Poziom cukru we krwi był znacznie niższy w grupie SP600125 leczonej NeuroD1 niż w grupie NeuroD1 , która nie otrzymywała SP600125 ( p <0, 05), ale była wyższa niż normalne kontrole ( P <0, 05). Stało się tak z powodu powrotu hiperglikemii u dwóch z sześciu szczurów leczonych SP600125.

Image

Barwienie w tunelu (zielone) od normalnych kontroli (u góry po lewej), kontroli tylko STZ (u góry po prawej) i szczurów traktowanych NeuroD1 bez wstępnej obróbki SP600125 (dolny lewy) i ze wstępną obróbką SP600125 (prawy). Jądra wybarwia się DAPI (niebieski), a komórki β anty-insuliną (czerwony); komórki apopotyczne są zielone. Wstępna obróbka SP600125 chroni zregenerowane wysepki przed apoptozą (prawy dolny róg).

Pełny rozmiar obrazu

Image

Wyniki eksperymentów SP600125 po 90 dniach. Reprezentatywne skrawki histologiczne szczurów leczonych terapią genową NeuroD1 bez SP600125 (u góry po lewej) i SP600125 (u dołu po lewej). Rozproszone komórki β zabarwione anty-insuliną (brązową) są obecne 90 dni po UTMD pod nieobecność SP600125. Dobrze uformowane rdzenie wysp są obecne 90 dni po UTMD w obecności SP600125. Masa komórek β jest znacznie większa w grupie SP600125 ( P <0, 0001; prawy górny wykres). Poziom glukozy we krwi jest niższy u szczurów traktowanych NeuroD1, które otrzymały SP600125 w porównaniu z tymi, które nie otrzymały SP600125 ( P <0, 05), ale jest wyższy niż u normalnych kontroli ( P <0, 05).

Pełny rozmiar obrazu

Dyskusja

Według naszej wiedzy, jest to pierwsze badanie, które wykazało regenerację wysepek trzustkowych in vivo z wyzdrowieniem z cukrzycy bez użycia wektora wirusowego. W szczególności, NeuroD1 był ukierunkowany na trzustkę szczurów traktowanych STZ, a następnie regenerację prawie normalnie wyglądających wysepek i przywrócenie normalnego poziomu glukozy, insuliny i peptydu C we krwi po 30 dniach. Maksymalną ekspresję genów reporterowych dostarczanych jako plazmidy przez UTMD obserwowano po 4 dniach, a następnie szybko ulegała degradacji. 8 Tym samym przejściowa ekspresja genów za pomocą tej metody może indukować regenerację wysp, teoretycznie minimalizując ryzyko mutagenezy insercyjnej, która może być związana z przedłużoną ekspresją egzogennej terapii genowej. Wstępnie lecząc szczury SP600125, który, jak wykazano, blokuje apoptozę komórek β, byliśmy w stanie wydłużyć czas regeneracji wysp i normoglikemii do 90 dni w szczurzym modelu cukrzycy indukowanej przez STZ.

NeuroD1 jest podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym helisa-pętla-helisa występującym w trzustce, jelicie i ośrodkowym układzie nerwowym. 15 NeuroD1 jest obecny przy rozwoju pąka trzustki i pozostaje wykrywalny we wszystkich dojrzałych typach komórek wysp trzustkowych. U myszy z nokautem NeuroD1 rozwijają się wszystkie typy komórek hormonalnych, ale występuje mniejsza liczba wysepek i zwiększona apoptoza komórek β. 16 Uważa się, że NeuroD1 nie jest niezbędny do wczesnego różnicowania, ale odgrywa ważną rolę w późniejszym różnicowaniu i utrzymaniu komórek β oraz w określaniu losu komórek. 17, 18 Ten pogląd na rolę NeuroD1 w rozwoju endokrynologicznym, choć oparty głównie na badaniach na myszach transgenicznych, jest zgodny z obserwowanym w tym badaniu obserwowanym odnowieniem wysepek u dorosłych szczurów.

Inne czynniki transkrypcyjne, w szczególności Ngn3, Pax4, Nkx2.2, Nkx6.1 i MafA, również powodowały regenerację wysepek, ale wysepki składały się głównie z komórek α, a poziomy glukozy we krwi, insuliny i peptydu C nie były znormalizowane. Co ciekawe, transgeniczne myszy wyrażające Ngn3 pod kontrolą promotora Pdx1 wykazują głównie komórki dodatnie pod względem glukagonu, 19 podobnie jak nasze ustalenia po dostarczeniu Ngn3 in vivo . Gdy Ngn3 ulega nadekspresji w rozwoju jelit drobiowych, produkuje również głównie komórki α. 20 Wydaje się prawdopodobne, że rola tych czynników transkrypcyjnych, gdy są one dostarczane egzogennie dorosłym zwierzętom z cukrzycą, może różnić się od ich roli w rozwoju embriologicznym. Możliwe jest również, że różne kombinacje genów czynników transkrypcyjnych lub innych genów związanych z rozwojem trzustki lub cyklem komórkowym doprowadziłyby do jeszcze silniejszej regeneracji wysepek niż obserwowana w tym badaniu. Na przykład Chen i in. 10 wykazało, że wytwarzanie insuliny przez komórki szpikowe można indukować u szczurów traktowanych STZ przez połączenie betaceluliny i plazmidów Pdx1 dostarczonych in vivo z przywróceniem prawidłowego poziomu glukozy i insuliny we krwi do 15 dni. Niedawno Zhou i in. 11 podało, że kombinacja Ngn3 , MafA i Pdx1 , dostarczona przez bezpośrednie wstrzyknięcie adenowirusa do trzustki myszy z niedoborem odporności, spowodowała przeprogramowanie komórek zewnątrzwydzielniczych do fenotypu komórek β. Te nowe komórki β izolowano w pojedyncze komórki lub małe skupiska tylko kilku komórek, zamiast agregować w wysepki. Poziomy glukozy we krwi, insuliny i peptydu C uległy poprawie, ale nie zostały przywrócone do normalnych poziomów. Po dostarczeniu czynników pojedynczej transkrypcji nowe komórki β nie były widoczne w znacznej liczbie. Badanie to różni się dwoma potencjalnie ważnymi aspektami. Po pierwsze, zastosowaliśmy niewirusową metodę dostarczania genów, która w przeciwieństwie do bezpośredniego wstrzyknięcia, skierowana jest na całą trzustkę. Po drugie, wykorzystaliśmy promotor RIP3.1 do selektywnego ukierunkowania ekspresji genów na trzustkę wydzielania wewnętrznego. Powszechnie stosowany promotor wirusa cytomegalii jest bardziej skuteczny w zewnątrzwydzielniczej niż w trzustkowej trzustce. 21 Podobnie, adenowirus jest bardziej odporny na zewnątrzwydzielniczą niż wewnątrzwydzielniczą trzustkę. Regeneracja wysepek została osiągnięta w cukrzycy, w której pośredniczy STZ, poprzez zastosowanie adenowirusa do dostarczania różnych genów do wątroby, w wyniku czego przywraca się prawidłowy poziom glukozy we krwi. 4, 5 Jednak adenowirus nie będzie prawdopodobnie stosowany u ludzi ze względów bezpieczeństwa. Chociaż wątroba jest odpowiednim organem do regeneracji wysp i przeszczepu wysp, nasza technika wykorzystuje niszczenie mikropęcherzyków za pośrednictwem ultradźwięków w celu dostarczenia plazmidowego cDNA do całej trzustki ze stosunkowo silną specyficznością narządu. Daje to teoretyczną korzyść dla regeneracji i utrzymania wysepek, ponieważ trzustka jest normalnym środowiskiem fizjologicznym dla wysepek. Podobnie jak w naszych poprzednich badaniach dostarczania genów przez UTMD, 8, 9, 10, nie znaleźliśmy żadnych dowodów uszkodzenia trzustki przez UTMD, ani przez amylazę w surowicy, ani przez lipazę, ani przez histologię.

Nie przeprowadziliśmy kompleksowych badań linii komórkowej. Jednak kilka obserwacji sugeruje, że zregenerowane wysepki obserwowane po RIP3.1- NeuroD1 wynikają z replikacji rozproszonych komórek β, które przeżyły STZ. Barwienie immunofluorescencyjne za pomocą CK19, markera komórek przewodowych, nie wykazało żadnego znaczącego wychwytu w zregenerowanych wyspach (danych nie pokazano). Regenerację wysepek obserwowano tylko wtedy, gdy dostarczanie genów podano bezpośrednio po leczeniu STZ lub w ciągu 48 godzin po leczeniu. Gdy eksperymenty powtórzono z dostarczaniem genów 7 dni po STZ, okresie, w którym nie było wykrywalnych komórek wybarwiających insulinę u szczurów kontrolnych STZ, regeneracja wysepek nie była obserwowana i nastąpił postęp ciężkiej hiperglikemii i utrata masy ciała. Kolokalizacja Ki67 i insuliny była obecna w zregenerowanych wyspach, co sugeruje proliferację komórek β. Zastosowaliśmy modyfikację szczurzego promotora insuliny I, który jest silnie specyficzny dla komórek β, szczególnie w warunkach hiperglikemii 8, 9 i nie oczekuje się, że będzie wykazywał znaczną aktywność w zewnątrzwydzielniczej trzustce. Te rozważania są zgodne z panującym poglądem, że replikacja komórek β jest dominującym mechanizmem zwiększania masy komórek β. 13, 23, 24

Koncepcja zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji wysepek u osób chorych na cukrzycę jest prawdopodobna. Meier i in. wykazało, że 88% próbek autopsji od dorosłych ludzi z długotrwałą cukrzycą typu 1 miało znaczną liczbę komórek β, a także apoptozę komórek β i naciek limfocytów T. 25 Tak więc istniejące komórki β są potencjalnym celem regeneracyjnej terapii genowej za pomocą NeuroD1, samodzielnie lub w połączeniu z innymi czynnikami transkrypcyjnymi. Jednak każda strategia regeneracji wysp będzie musiała uwzględniać potencjalne zniszczenie nowych wysp przez apoptozę, zapalenie lub autoimmunizację. 2 Zastosowaliśmy SP600125 w celu zmniejszenia apoptozy komórek β i przedłużenia czasu skuteczności po terapii genowej NeuroD1 . Powinno być możliwe łączenie genów regeneracyjnych z genami lub lekami, które hamują apoptozę, 14, 26, 27, 28 i / lub odpowiedź autoimmunologiczną. W odniesieniu do tego ostatniego, ostatnie dowody sugerują, że takrolimus i syrolimus mogą mieć bezpośredni toksyczny wpływ na komórki β. 29 Zatem optymalny schemat immunosupresyjny do ochrony wysepek może jeszcze nie zostać ustalony. Wreszcie istnieją ważne różnice między biologią gryzoni i ludzkich wysepek; 2 stąd te ustalenia należy potwierdzić u zwierząt wyższego rzędu, zanim można będzie rozważyć próby na ludziach.

Materiały i metody

Promotory insuliny szczurzej i konstrukty plazmidowe

Genomowy DNA szczura Sprague-Dawley ekstrahowano z krwi obwodowej szczura za pomocą zestawu QIAamp Blood (Qiagen Inc., Valencia, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Fragmenty promotora genu insuliny szczurzego I (-412 do +165) amplifikowano z genomowego DNA szczura Sprague-Dawley przy użyciu PCR. Powstałe fragmenty DNA subklonowano do wektora reporterowego pDsRed1-1 (Clonetech, Mountain view, CA, USA). cDNA hMafA i cDNA chomika Nkx6.1 zostały podarowane lub serdecznie obdarowane przez laboratorium Olson (East Lansing, MI, USA) na Michigan State University oraz przez laboratorium Newgard (Durham, Karolina Północna, USA) w Duke University Medical Center. CDNA szczurów Ngn3 , NeuroD1 , Pax4 i Nkx2.2 były produktami PCR z puli cDNA nowonarodzonej trzustki szczura Sprague-Dawley, które zostały odwrócone od całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki trzustki noworodka szczura zamrożono błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w -86 ° C. Zamrożone próbki rozmrożono w 1 ml roztworu RNA-STAT i natychmiast homogenizowano przy użyciu homogenizatora polytron przy 10 000 obr / min przez 30 sekund. Całkowity RNA (30 ng) poddano odwrotnej transkrypcji w 20 μl przy użyciu zestawu Sensiscript RT (Qiagen Inc.) z oligo (dT) 16. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 42 ° C przez 50 minut, a następnie kontynuowano inkubację w 70 ° C przez 15 minut. PCR przeprowadzono dla wszystkich próbek przy użyciu GeneAmp PCR System 9700 (PE ABI, Foster City, CA, USA) w objętości 50 μl zawierającej 2 μl cDNA, 25 μl Master Mix HotStarTaq (Qiagen Inc.) i 20 pmol każdego startera . Odpowiednie produkty PCR zweryfikowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym i oczyszczono za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Inc.). Aby potwierdzić sekwencje, produkty PCR sekwencjonowano bezpośrednio przy użyciu zestawu dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) na analizatorze genomowym ABI 3100 (Van Allen Way, Carlsbad, Kalifornia, USA). Wszystkie cDNA genów czynnika transkrypcyjnego subklonowano do wektora kierującego RIP3.1. Trawienie plazmidu, ligacja, subklon, izolacja i oczyszczanie przeprowadzono standardowymi procedurami i po raz kolejny sekwencjonowano, aby potwierdzić, że nie występowały żadne sztuczne mutacje.

Protokoły zwierzęce i UTMD

Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) i po uzyskaniu zgody naszego lokalnego IACUC. Lewy brzuch i szyja samców szczurów Sprague-Dawley (230–270 g) znieczulono dootrzewnową ketaminą (60 mg kg -1 ) i ksylazyną (5 mg kg -1 ) ogolono, a także rurkę polietylenową (PE 50, Becton Dickinson, Franklin Lakes, TN, USA) wprowadzono do prawej żyły szyjnej przez wycięcie.

W sumie 45 szczurów otrzymało jeden z dziewięciu zabiegów: (1) brak leczenia (normalne szczury kontrolne, n = 3); (2) samo leczenie STZ (60 mg kg -1 na dootrzewnowo, Sigma, St Louis, MO, USA) bez UTMD ( n = 3); (3) traktowanie STZ i UTMD DsRed ( n = 3); (4) z STZ i UTMD z ngn3 ( n = 6); (5) STZ i UTMD z NeuroD1 ( n = 6); (6) STZ i UTMD z Pax4 ( n = 6); (7) STZ i UTMD z Nkx2, 2 ( n = 6); (8) STZ i UTMD z Nkx6.1 ( n = 6); (9) z STZ i UTMD z MafA ( n = 6). Wszystkie geny dostarczono jako plazmidowy cDNA pod kontrolą promotora RIP3.1. Poziom glukozy we krwi mierzono 12 godzin po wstrzyknięciu STZ. Zwierzęta z poziomem glukozy we krwi na czczo przekraczającym 250 mg na 100 ml uznano za udane modele cukrzycy typu 1, a następnie poddano UTMD w ciągu 48 godzin od leczenia STZ. Roztwory mikropęcherzykowe lub kontrolne (0, 5 ml rozcieńczone 0, 5 ml roztworu buforowanego fosforanem (PBS)) infuowano przez ponad 10 minut przy użyciu pompy (Genie, Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Podczas infuzji ultradźwięki kierowano do trzustki za pomocą dostępnego w handlu przetwornika ultradźwiękowego (S3, Sonos 5500, Philips Ultrasound, Bothell, WA, USA). Sonda została zaciśnięta na miejscu. Następnie zastosowano ultradźwięki w trybie ultraharmonicznym (transmisja 1, 3 MHz / odbiór 3, 6 MHz) przy mechanicznym indeksie 1, 4. Cztery impulsy ultradźwiękowe zostały wyzwolone do co czwartego skurczu końcowego za pomocą elektrokardiogramu z opóźnieniem 45–70 ms po szczycie fali R. Wykazano, że te ustawienia są optymalne dla dostarczania plazmidu przez UTMD za pomocą tego instrumentu. 8 Zniszczenie pęcherzyków było wizualnie widoczne u wszystkich szczurów. Po UTMD przywiązano żyłę szyjną, skórę zamknięto i zwierzętom pozwolono się zregenerować. Próbki krwi pobierano po nocnym 12-godzinnym poście na początku badania oraz w różnych dniach po leczeniu. Ten protokół powtórzono trzykrotnie, zabijając 135 szczurów zabitych w dniach 10 ( n = 45), 20 ( n = 45) i 30 ( n = 45), stosując przedawkowanie pentobarbitalu sodu (120 mg kg -1 ). Trzustkę, wątrobę, śledzionę i nerkę zebrano do badania histologicznego. Poziom glukozy we krwi mierzono za pomocą paska testowego glukozy we krwi (Precision, Abbott, Abbott Park, IL, USA); Poziomy insuliny we krwi i peptydu C mierzono za pomocą zestawu RIA (Linco Research, Radioimmunoassay, Billerica, MA, USA).

W 90-dniowych eksperymentach UTMD podawano tylko RIP3.1 - NeuroD1 ( n = 6), wraz z trzema normalnymi kontrolami, w których nie podano STZ, oraz trzema kontrolami STZ. Eksperyment ten powtórzono następnie ze wstępnym traktowaniem szczurów SP600125 ( n = 6) przed UTMD z RIP3.1- NeuroD1 i bez takiego wstępnego traktowania ( n = 6).

Produkcja mikrobąbelków stabilizowanych lipidami zawierających plazmid

Mikrobąbelki stabilizowane lipidami przygotowano jak opisano wcześniej w naszym laboratorium. W skrócie, przygotowano roztwór podstawowy zawierający 270 mg 1, 2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny (Sigma), 30 mg 1, 2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminy (Sigma) i 1 g glukozy. Składniki te rozpuszcza się we wrzącej łaźni wodnej na 20–30 minut, pipetując zawartość w górę i w dół, aż nie pozostaną widoczne cząstki. Ten roztwór podstawowy jest przechowywany w 4 ° C. Mikropęcherzyki zawierające plazmid przygotowuje się przez zmieszanie 2 mg wysuszonego plazmidu z 50 μl lipefektaminy 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i inkubację w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Tę liposomową lub plazmidową mieszaninę DNA dodaje się do 250 ml podstawowego roztworu lipidów, 50 ml czystego glicerolu i 5 μl 10% roztworu albuminy, dobrze miesza się z pipetą, a następnie umieszcza w lodzie. Podwielokrotności 0, 5 ml tego roztworu fosfolipid-plazmid umieszczono w 1, 5 ml przezroczystych fiolkach; powietrze w wolnej przestrzeni fiolek jest zastąpione gazem perfluoropropanowym (Air Products and Chemicals Inc., Allentown, PA, USA). Each vial was incubated at 4 °C for 30 min and then mechanically shaken for 30 s by a dental amalgamator (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA, USA). The lipid-stabilized microbubbles appear as a milky white suspension floating on the top of a layer of liquid containing unattached plasmid DNA. The subnatant was discarded and the microbubbles were washed three times with PBS to remove unattached plasmid DNA. The mean diameter and concentration of the microbubbles in the upper layer were measured by a particle counter (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA; Multisizer III).

Immunohistochemia

Cryostat sections 5–8 μm in thickness were fixed in 4% paraformaldehyde for 15 min at 4 °C and quenched for 5 min with10 m M glycine in PBS. Sections were then rinsed in PBS three times, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 10 min. Sections were blocked with 10% goat serum at 37 °C for 1 hr and washed with PBS three times. The primary antibody (mouse anti-insulin antibody, 1:500 dilution (Sigma); rabbit anti-glucagon, 1:500; rabbit anti-somatostatin, 1:500; rabbit anti-pancreatic polypeptide, 1:500; rabbit anti-NeuroD1, 1:500; rabbit anti- Ki-67, rabbit anti-BrDu, 1:500; mouse anti-ck19, 1:2000 dilution (Chemicon, Temecula, CA)) was added and incubated for 2 hrs at room temperture. After washing with PBS three times for 5 min, the secondary antibody (Sigma; anti-mouse IgG conjugated with FITC; anti-rabbit lgG conjugated with Cy5, 1:500 dilution in block solution) was added and incubated for 1 hr at room temperature. Sections were rinsed with PBS for 10 min, five times, and then mounted.

Tunel staining

Tunel staining for detection and quantification of apoptosis in rat pancreas slides was performed using a commercially available kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) according to a standard protocol. DNA strand breaks at the single-cell level were labeled with fluorescein and imaged by fluorescence microscopy.

β-cell mass calculation

β-cell mass was evaluated by the method of Terauchi et al. 30 Sections of rat pancreas were immunostained with monoclonal mouse anti-insulin (1:500 dilution) and a second antibody, peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG (1:500 dilution), and developed in liquid DAB. Images from six consecutive pancreas sections were captured on a monitor screen of a digital imaging system (Olympus BX60, Nikon digital camera DXM1200C and NIS-Elements F2.30, Miami, FL, USA). The total areas of islet β-cells and whole pancreas were measured using NIH ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA). β-cell mass was calculated as the ratio of β-cells to whole pancreas for six consecutive pancreatic slides from each rat.

Analiza danych

Data were analyzed with Statview software (SAS, Cary, NC, USA). The results are expressed as mean±1s.d. Differences were analyzed by repeated measures ANOVA with Fisher's post hoc test and considered significant at P <0.05.